Accuracy of Real-Time Polymerase Chain Reaction in COVID-19 Patients

ABSTRACT Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a mild to severe respiratory illness caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). The diagnostic accuracy of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC)- or World Health Organization (WHO)-recommended real-time PCR (RT-qPCR) primers in clinical practice remains unproven. We conducted a prospective study on the accuracy of RT-qPCR using an in-house–designed primer set (iNP) targeting the nucleocapsid protein as well as various recommended and commercial primers. The accuracy was assessed by culturing or seroconversion. We enrolled 12 confirmed COVID-19 patients with a total of 590 clinical samples. When a cutoff value of the cycle threshold (C t ) was set to 35, RT-qPCRs with WHO RdRp primers and CDC N1, N2, and N3 primers showed sensitivity of 42.1% to 63.2% and specificity of 90.5% to 100% in sputum, and sensitivity of 65.2% to 69.6% and specificity of 65.2% to 69.6% in nasopharyngeal samples. The sensitivity and specificity of iNP RT-qPCR in sputum and nasopharyngeal samples were 94.8%/100% and 69.6%/100%, respectively. Sputum testing had the highest sensitivity, followed by nasopharyngeal testing ( P = 0.0193); self-collected saliva samples yielded better characteristics than oropharyngeal samples ( P = 0.0032). Our results suggest that iNP RT-qPCR has better sensitivity and specificity than RT-PCR with WHO ( P < 0.0001) or CDC (N1: P = 0.0012, N2: P = 0.0013, N3: P = 0.0012) primers. Sputum RT-qPCR analysis has the highest sensitivity, followed by nasopharyngeal, saliva, and oropharyngeal assays. Our study suggests that considerable improvement is needed for the RT-qPCR WHO and CDC primer sets for detecting SARS-CoV-2. IMPORTANCE Numerous research campaigns have addressed the vast majority of clinical and diagnostic specificity and sensitivity of various primer sets of SARS-CoV2 viral detection. Despite the impressive progress made to resolve the pandemic, there is still a need for continuous and active improvement of primers used for diagnosis in clinical practice. Our study significantly exceeds the scale of previously published research on the specificity and sensitivity of different primers comparing with different specimens and is the most comprehensive to date in terms of constant monitoring of primer sets of current usage. Henceforth, our results suggest that sputum samples sensitivity is the highest, followed by nasopharyngeal, saliva, and oropharyngeal samples. The CDC recommends the use of oropharyngeal specimens, leading to certain discrepancy between the guidelines set forth by the CDC and IDSA. We proved that the oropharyngeal samples demonstrated the lowest sensitivity for the detection of SARS-CoV-2.

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【저자키워드】 COVID-19, SARS-CoV-2, sensitivity, specificity, real-time polymerase chain reaction, RdRp-gene, E gene, NP gene, 【초록키워드】 coronavirus disease, Saliva, Coronavirus disease 2019, coronavirus, SARS-CoV2, pandemic, Prospective Study, diagnostic, Diagnosis, Respiratory illness, prevention, severe acute respiratory syndrome Coronavirus, sputum, RT-PCR, nucleocapsid protein, clinical samples, RT-qPCR, Diagnostic accuracy, Seroconversion, Viral, Characteristics, Accuracy, Sensitivity and specificity, Real-time PCR, CDC, cycle threshold, nasopharyngeal, qPCR, disease control, Research, Control, RdRP, Mild, WHO, Viral detection, Oropharyngeal, respiratory, severe respiratory illness, specimens, Clinical practice, Analysis, COVID-19 patient, followed by, Health Organization, diagnostic specificity, Sputum sample, World Health Organization, acute respiratory syndrome, acute respiratory syndrome coronavirus, acute respiratory syndrome coronavirus 2, house, Nasopharyngeal samples, specimen, center, primer sets, primer, RT-qPCRs, discrepancy, cutoff value, Primers, qPCR analysis, oropharyngeal samples, nasopharyngeal sample, lowest, enrolled, highest, caused, significantly, primer set, assays, conducted, majority, demonstrated, addressed, Numerous, CDC N1, N2, 【제목키워드】 reaction, chain,

요약 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로 인한 경증에서 중증의 호흡기 질환입니다. 질병통제예방센터(CDC) 또는 세계보건기구(WHO)가 권장하는 임상 실습에서 실시간 PCR(RT-qPCR) 프라이머의 진단 정확도는 여전히 입증되지 않았습니다. 우리는 뉴클레오캡시드 단백질을 표적으로 하는 자체 설계된 프라이머 세트(iNP)와 다양한 권장 및 상용 프라이머를 사용하여 RT-qPCR의 정확도에 대한 전향적 연구를 수행했습니다. 정확도는 배양 또는 혈청 변환에 의해 평가되었습니다. 총 590개의 임상 샘플과 함께 12명의 확인된 COVID-19 환자를 등록했습니다. 사이클 임계값(C t )의 컷오프 값을 35로 설정했을 때 WHO RdRp 프라이머와 CDC N1, N2 및 N3 프라이머를 사용한 RT-qPCR은 비인두 샘플에서 65.2%에서 69.6%의 민감도와 65.2%에서 69.6%의 특이도. 객담 및 비인두 검체에서 iNP RT-qPCR의 민감도와 특이도는 각각 94.8%/100% 및 69.6%/100%였습니다. 객담 검사의 민감도가 가장 높았고 비인두 검사가 그 뒤를 이었습니다(P = 0.0193). 자가 채취한 타액 샘플은 구인두 샘플보다 더 나은 특성을 나타냈다( P = 0.0032). 우리의 결과는 iNP RT-qPCR이 WHO(P <0.0001) 또는 CDC(N1: P = 0.0012, N2: P = 0.0013, N3: P = 0.0012) 프라이머를 사용한 RT-PCR보다 더 나은 감도와 특이성을 가지고 있음을 시사합니다. Sputum RT-qPCR 분석은 가장 민감도가 높았고 비인두, 타액, 구강인두 분석이 그 뒤를 이었습니다. 우리의 연구는 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 RT-qPCR WHO 및 CDC 프라이머 세트에 상당한 개선이 필요함을 시사합니다. 중요 수많은 연구 캠페인에서 SARS-CoV2 바이러스 검출의 다양한 프라이머 세트의 임상 및 진단 특이성과 민감도의 대다수를 다루었습니다. 대유행을 해결하기 위한 눈부신 진전에도 불구하고, 임상에서 진단에 사용되는 프라이머의 지속적이고 적극적인 개선이 여전히 필요합니다. 우리의 연구는 다른 표본과 비교하여 다른 프라이머의 특이성 및 민감도에 대해 이전에 발표된 연구의 규모를 크게 초과했으며 현재 사용되는 프라이머 세트의 지속적인 모니터링 측면에서 현재까지 가장 포괄적입니다. 이후로, 우리의 결과는 객담 샘플 민감도가 가장 높고 비인두, 타액 및 구인두 샘플 순임을 시사합니다. CDC는 구인두 표본의 사용을 권장하므로 CDC와 IDSA가 제시한 지침 간에 일정한 불일치가 발생합니다. 우리는 구인두 샘플이 SARS-CoV-2 검출에 대해 가장 낮은 민감도를 나타냄을 입증했습니다.